دانلود تحقیق کامل درمورد الکتروفورز
دانلود تحقیق کامل درمورد الکتروفورزبه سبب اینکه ماکرومولکول های زیستی مانند دی‌ان‌ای و پروتئین ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی, آنها را بر اساس
دانلود تحقیق کامل درمورد الکتروفورز لینک پرداخت و دانلود *پایین مطلب*
فرمت فایل:Word (قابل ویرایش و آماده پرینت)
تعداد صفحه: 21
الکتروفورز
به سبب اینکه ماکرومولکول های زیستی مانند دی ان ای و پروتئین ها باردار هستند می توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می شود. روش های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسید های نوکلئیک یا پروتئین ها ابداع شده است.
الکتروفورز ژل
از یک محیط نیمه جامد (ژل) به عنوان فاز ثابت استفاده می شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید ( PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز تقسیم می شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسید های نوکلئیک به کار گرفته می شود. به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، به سبب اینکه پروتئین ها دارای بار مختلف هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیائی SDS (سدیم دو دسیل سولفات ) اضافه می شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می باشد. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل می شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می شود که باعث القاء بارمنفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می شود. هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می نماید. برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر وآسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می گیرد. معمولاً برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگ تر از 500 جفت باز) در صورتیکه هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته ای و قطعات DNA تک رشته ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می شود. قدرت تفکیک ژل های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه 100 جفت باز از آگاروز 3% و برای قطعات حدود 2000 جفت باز از آگارز 8/0 % استفاده می شود. در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل هم زمان با الکتروفورز استفاده می شود. به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب های اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می شود. در این ژل ها مولکول های کوچک تر در مقایسه با مولکول های بزرگ تر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می کنند. از روش PAGE برای بررسی جهش ها و تعیین توالی دی ان ای استفاده می شود.
تاریخچه ی الکتروفورز دو بعدی
الکتروفورز روشی است که در آن نمونه هایی که بار الکتریکی دارند، تحت تأثیر یک میدان الکتریکی از میان شبکه ای متخلخل حرکت می کنند و از یکدیگر جدا می شوند. سیر تکوین وتکامل این روش در جداسازی پروتئینها ارتباط تنگاتنگی با تلاشهای انجام شده در بررسی پروتئینهای سرم دارد.
در سال1937، "Tiselius" روشی برای جداسازی الکتروفورتیک پروتئینهای سرم ابداع کرد. انگیزه اصلی برای طراحی این روش، که بعدها به الکتروفورز منطقه ای " Zone Electrophoresis" مشهور شد، مشکلاتی بود که درحین بررسی پروتئینهای سرم وجود داشت. "Tiselius" برای اولین بار فراکشن های آلفا ، بتا، و گاما را در سرم تشریح و نام گزاری کرد. وی به خاطر تحقیق بر روی الکتروفورز و آنالیز جذبی، بخصوص اکتشافاتی که ماهیت پیچیده ی پروتئینهای سرم را مشخص می کرد، جایزه ی نوبل شیمی را در سال 1948 از آن خود کرد.
نقطه ی عطف در توسعة الکتروفورز در دهه های 40 و 50 زمانی روی داد که علاوه بر الکتروفورز منطقه ای دو روش دیگر نیز ظهور کردند: ایزوالکتروفوکوسینگ ", IEFIsoelectrofocusing" و ایزوتاکوفورزیز " Isotachophoresis". بنابراین در آن زمان امکان انجام آنالیزهای جداسازی الکتروفورتیک سه گانه بر روی مخلوطهای پروتئینی یا بصورت جدا یا در ترکیب با همدیگر بوجود آمد.
اولین تجارب در جداسازی توسط الکتروفورز دوبعدی به کارهای Smithies و Poulik در سال 1956 باز می گردد که با بکار بردنِ ترکیبی از الکتروفورز بر روی کاغذ و بر روی ژل نشاسته پروتئین های سرم را جداو تفکیک کردند.
پیشرفتهای بعدی در فناوری الکتروفورز، نظیر استفاده از پلی آکریل آمید و استفاده از شیبهای غلظتی پلی آکریل آمید، به سرعت در جداسازی های دو بعدی به کار گرفته شد. به خصوص استفاده از"IEF" در جداسازی دو بعدی این امر را امکان پذیر ساخت که جداسازی بُعد اول بر پایه خصوصیات بار الکتریکی پروتین ها صورت پذیرد. در سال 1970 الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید به همراه سدیم دو دسیل سولفات " Sodium Dodecylsulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE" توسط "Laemmli" معرفی شد. ترکیب "IEF" با "SDS-PAGE" در بُعد دوم منجر به ابداع روشی گشت که پروتئین ها را بر پایه دوعامل متفاوت یعنی بار الکتریکی و جرم مولکولی از یکدیگر جدا می ساخت. این روش برای انواع متفاوتی از نمونه ها با خواص حل پذیری متفاوت انطباق یافت؛ بدین معنی که استفاده از اوره و دترجنت های غیریونی در "IEF"، امکان محلول سازی نمونه های متفاوت را فراهم نمود. بدین ترتیب تا سال 1975 یک سیستم الکتروفورز دوبعدی تکامل یافت که می توانست برای آنالیز مخلوط های پروتئینی بدست آمده از کلِ یک سلول یا بافت ها بکار گرفته شود. براساس این پیشرفتها "O’Farrell" درسال 1975 روش الکتروفورز دوبعدی را که برای جداسازی پروتئینهای "E.coli" بهینه شده بود، گزارش کرد. او در این روش از ایزوالکتروفوکوسینگ در ژلهای پلی آکریل آمید استوانه ای که حاوی 8% اوره و 2% "NP40" بود، در ترکیب با"SDS-PAGE" ناپیوسته ی"Laemmli" استفاده کرد.
ترکیب جداسازی بر پایه بارالکتریکی (نقطه ایزوالکتریک یاpI) وجداسازی براساس اندازه (جرم مولکولی نسبی یا Mr ) باعث می شود که پروتئین های نمونه در پهنای ژلِ دوبعدی توزیع شوند. این شگرد اساس پیشرفت و تکامل الکتروفورز دوبعدی را در 30 سال بعدی تشکیل داد به طوری که تا کنون هزاران مقاله با استفاده از آن انتشار یافته است.
3- روشهای آماده سازی نمونه
قدم اول در آماده سازی نمونه, استخراج پروتئین ها از منبع مورد نظر است. ممکن است استخراج پروتئین ها مستقیما" توسط بافر محلول سازی "Solubilization buffer" صورت پذیرد. ممکن است این عمل توسط روش های متلاشی ساختن سلولها "Cell disruption" و بافتها انجام شود و سپس پروتئین های استخراج شده در بافر محلول سازی کاملا" حل شوند. برای استخراج کامل پروتئینهای داخل سلولی، سلول باید کاملا" متلاشی شود. انتخاب روش متلاشی سازی بستگی به این دارد که نمونه از چه منبع بیولوژیکی, از سلول, بافت جامد و یا از منابع دیگری, بدست آمده باشد. بعد از استخراج, این نمونه ها باید برای انجام الکتروفورز دوبعدی آماده شوند. منظور از آماده سازی نمونه, محلول ساختن حداکثر پروتئین های موجود و حفظ حلالیت آنها در حین روند الکتروفورز دو بعدی است.
هیچ روش منفردی را نمی توان بصورت عمومی برای آماده سازی نمونه هایی که توسط الکتروفورز دو بعدی مورد بررسی قرار می گیرند, معرفی کرد. در واقع ماهیت متفاوت نمونه ها امکان بکار گیری روشی یکسان را در آماده ساختن آنها برای الکتروفورز دو بعدی منتفی می سازد. از طرفی دیگر، روش بکار گرفته شده در هر تجربه ای به هدف طراحی شده نیز بستگی دارد. برای مثال, ممکن است هدف از انجام الکتروفورز دوبعدی دستیابی به پروتئینهایی با ویژگی های خاص باشد یا ممکن است دستیابی به نقشه کامل از پروتینهای نمونه از اهمیت بیشتری برخوردار باشد, در هر یک از این موارد استراتژی های انتخابی کاملا" متفاوت خواهند بود. در بهینه ساختن استراتژی آماده سازی نمونه باید از نتایج موردنظر, انتظاری مشخص داشت؛ باید برای ما مشخص باشد که نشان دادن نمونه بطور کامل مهمتر است یا بدست آوردن یک الگوی تکرارپذیر.
اضافه تر کردن مراحل آماده سازی نمونه می تواند کیفیت نتیجه نهایی را بهتر کند, اما این امر به قیمت از دست دادن گروهی از پروتئینها تمام می شود. به هرحال, این تناقص و نسبت معکوس بین کیفیت نمونه بهبود یافته و نمونه سازی کامل پروتئینها باید کاملا"درنظر گرفته شود.
در هر صورت, خطوط راهنمای کلی برای آماده سازی نمونه وجود دارد که با پی گیری آنها می توان قدمهای نخست را در این راه به درستی برداشت و سپس با تجربه بهترین نتیجه را بدست آورد
3-1 رهنمودهای کلی در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز دو بعدی
روش بکار گرفته شده در آماده سازی نمونه باید علاوه بر کارآمد بودن, قابلیت تکرارپذیری نیز داشته باشد. این امر رمز انجام موفقیت آمیز الکتروفورز دوبعدی است. در روش بکار گرفته شده ممکن است از بافری ساده برای محلول سازی یا از مخلوطی پیچیده حاوی عوامل کائوتروپیک "Chaotropic reagents"، دترجنت ها "Detergents" و عوامل احیاء کننده استفاده شود. در هر حال بهینه کردن روش آماده سازی نمونه بصورت تجربی صورت می پذیرد و برای دستیابی به این مهم می توان برخی رهنمودهای کلی را در آماده سازی نمونه درنظرگرفت:
به حداقل رساندن مراحل آماده سازی نمونه. افزایش در مراحل آماده سازی نمونه ممکن است کیفیت نتیجه نهایی را بهبود بخشد, اما این امر ممکن است با هزینه احتمالی از دست دادن پروتئینها همراه باشد .
به حداقل رساندن تغییرات پروتئینی ناشی از عوامل داخلی و خارجی. چنین تغییراتی می توانند سبب ظهور نقاطی مصنوعی در نمایه ی ژل الکتروفورز دو بعدی شوند. برای مثال نمونه هایی که حاوی اوره هستند نباید حرارت داده شوند چون تخریب حرارتی اوره ایجاد ایزوسیانات می نماید. ایزوسیانات حاصل می تواند با کاربامیله کردن "Carbamilation" پروتئین ها سبب هتروژنی قابل ملاحظه ای در بار الکتریکی شود و ایجاد نقاط غیر واقعی در نمایه الکتروفورز دو بعدی نماید.
علاوه بر این پروتئازهای موجود در نمونه ها با تخریب آنزیماتیک پروتئینها به سهولت ایجاد نقاط غیر واقعی می نمایند. به همین دلیل نمونه ها باید حدالامکان درکمترین حد ممکن دستکاری شوند و در تمام طول مدت کار خنک نگهداری شوند. معجون های وقفه دهنده ی پروتئازی "Protease inhibitors cocktails" را می توان به نمونه اضافه کرد، اما این نکته را باید درنظر گرفت که چنین موادی نیز ممکن است سبب هتروژنی در بار الکتریکی پروتئینها و در نتیجه ظهور نقاط غیر واقعی شوند.
- محلول ساختن همه ی انواع پروتئینها, از جمله پروتئینهای آبگریز به شکلی تکرارپذیر. برخی پروتئینها بطور طبیعی به صورت کمپلکسهایی در غشاء هستند. یا برخی ها در کمپلکسهایی با اسیدنوکلئیک پیدا می شوند. برخی دیگر ایجاد توده های "Aggregates" غیراختصاصی متفاوتی می کنند. روش محلول سازی باید طوری تمامی باندهای غیرکوالان در کمپلکسها و توده های پروتئینی را تخریب کند که محلولی از پلی پپتیدهای منفرد ایجاد شود.
در غیر این صورت, کمپلکسهای پروتئینی نقاط جدیدی را در نمایه دوبعدی ایجاد می نمایند که همزمان منجر به کاهش شدت نقاط مربوط به پلی پپتیدهای منفرد تشکیل دهنده اشان می شوند. کارآمد بودن بستگی به انتخاب روش محلول سازی دارد . انتخاب دترجنت ها و ترکیب بافر محلول سازی بسیار پر اهمیت است. اگر هریک از این مراحل بهینه نشوند، ممکن است جداسازی ناقص انجام شده و بهرحال اطلاعات پر اهمیتی از دست داده شوند.
- ممانعت از توده شدن پروتئینها در حین محلول سازی و در طی مراحل بعدی الکتروفورز و جلوگیری از رسوب کردن پروتئین ها و ازبین رفتن حلالیت آنها در حین ایزوالکتروفوکوسینگ.
- خارج ساختن اسیدهای نوکلئیک و دیگر مولکولهای تداخل کننده نظیر لیپیدها, پلی ساکاریدها, و نمکها که در ایزوالکتروفوکوسینگ اختلال ایجاد می نمایند.
- تمام موادی که می توانند ذراتی را تشکیل دهند باید با اولتراسانتریفوژ خارج کرد. قطعات جامد و لیپیدها باید از محلول خارج شوند چراکه می توانند منافذ ژل را مسدود کنند .
- حذف پروتئینهایی با فراوانی بالا که دیگر پروتئین های مورد نظر در نمونه را تحت پوشش خود قرار می دهند. مثلا" حذف آلبومین یا ایمونوگلوبولین ها از پلاسما در بررسی دیگر پروتئینهای موجود در پلاسما. این کار موجب دستیابی به پروتئینهای موردنظر درسطوح قابل اندازه گیری می گردد.
روش های آماده سازی مطلوب برای تمونه های بدست آمده از منابع متفاوت اختلاف فاحشی با یکدیگر دارند. این امر به خاطر ماهیت و ساختار این منابع است. در این قسمت به انواع نمونه های مورد استفاده می پردازیم.
3-2-1- نمونه های محلولنمونه های محلول و مایع نظیر سرم, پلاسما, ادرار, مایع نخاعی و عصاره های مایع سلولها و بافت ها را می توان اغلب با کمترین دستکاری توسط الکتروفورز دو بعدی بررسی کرد. نمونه هایی نظیر پلاسما و سرم که دارای غلظت پروتئینی نسبتا" زیادی هستند را می توان مستقیما" بعد از رقیق کردن با بافر محلول کننده ی مناسب توسط الکتروفورز دو بعدی آنالیز کرد. با این حال فراوانی بالای پروتئینهایی چون آلبومین و ایمونوگلوبین ها باعث مخدوش شدن بسیاری از اجزای اقلیت در نمایه ی الکتروفورز دو بعدی می گردد. با خارج کردن این پروتئینها از محلول می توان بر این مشکل غلبه کرد، اما همیشه احتمال خارج کردن غیر اختصاصی دیگر اجزای پروتئینی نیز وجود دارد.
ممکن است نمونه های محلول دارای غلظت های نسبتا" کم پروتئینی بوده و یا حاوی غلظت های بالا از نمک هایی باشند که قادر به اختلال درجداسازی پروتئین ها درحین "IEF" باشند. چنین نمونه هایی را می شود قبل از الکتروفورز دو بعدی با دیالیز یا کروماتوگرافی, نمکزدایی کرد, سپس این نمونه ها نیاز به تغلیظ شدن دارند که توسط روشهایی چون لیوفیلیزاسیون، دیالیز درمقابل پلی اتیلن گلایکول، یا رسوب دادن توسط اسید تری کلرواستیک "Trichloroacetic acid, TCA" با استن انجام پذیرد.
رسوب دادن توسط "استن-TCA" برای غیرفعال کردن پروتئازها, خارج ساختن محتویات تداخل کننده، و برای غنی ساختن پروتئینهای بسیار قلیایی، نظیر پروتئینهای ریبوزومی، در محلول لیز شده ی سلولی بسیار مفید است.
این فقط قسمتی از متن مقاله است . جهت دریافت کل متن مقاله ، لطفا آن را خریداری نمایید
لینک پرداخت و دانلود *پایین مطلب* فرمت فایل:Word (قابل ویرایش و آماده پرینت) تعداد صفحه: 21 الکتروفورز به سبب اینکه ماکرومولکول های زیستی مانند دی‌ان‌ای و پروتئین ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می‌شود. ر ...